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马铃薯甲虫CncC与Keap1的鉴定及功能分析

[导读]:马铃薯甲虫CncC与Keap1的鉴定及功能分析 孙强昆 【摘要】: 果蝇的 CncC(cap 'n' collar isoform C)和 Keap1(Kelch-like ECH associated protein 1)通过协调一系列基因的转录来调控变态,其中转录调控所涉及的基因主要为蜕皮激素合成,20-羟基蜕皮酮(20E)信号和保幼激素(JH)降解的相关基因。然而迄今为止,CncC和Keap1信号途径调控蜕皮和保幼激素信号的功能在其它昆虫中尚未证实。本文采用生物信息学和分子生物学实验方法,基于马铃薯甲虫转录组...

马铃薯甲虫CncC与Keap1的鉴定及功能分析


孙强昆
【摘要】:果蝇的 CncC(cap 'n' collar isoform C)和 Keap1(Kelch-like ECH associated protein 1)通过协调一系列基因的转录来调控变态,其中转录调控所涉及的基因主要为蜕皮激素合成,20-羟基蜕皮酮(20E)信号和保幼激素(JH)降解的相关基因。然而迄今为止,CncC和Keap1信号途径调控蜕皮和保幼激素信号的功能在其它昆虫中尚未证实。本文采用生物信息学和分子生物学实验方法,基于马铃薯甲虫转录组和基因组数据,克隆了马铃薯甲虫CncC和Keap1的cDNA全长序列;构建dsLdCncC和dsLdKeap1干扰载体;通过RNA干扰技术,探究了LdCnc 和LdKeap1对马铃薯甲虫幼虫发育时间、羽化率及体重、蜕皮激素合成、20E信号通路和JH信号通路的影响。研究结果如下:1、马铃薯甲虫LdCncC和LdKeap1的克隆、序列分析及时空表达基于马铃薯甲虫的转录组和基因组数据、应用RT-PCR和RACE技术,我们发现LdCnc 有 4 个剪接异构体,LdCncA、LdCncB、LdCncC1和 LdCncC2。其中 LdCncA 和LdCncB为较短的序列,而LdCncC1和LdCncC2的第一个外显子不同,但是随后的10个外显子相同。LdKeap1基因有2个剪接异构体(LdKeap1A和LdKeap1B),它们的第一个外显子不同。进化分析结果表明,LdCncC蛋白和LdKeap1蛋白与鞘翅目其它昆虫的对应序列聚于一支。测定了L CncC和LdKeap1在不同龄期的表达水平,发现LdCncC和LdKeap1在每个龄期都有表达。在一龄、二龄和三龄幼虫的蜕皮前后,LdCncC和LdKeap1mRNA水平较高。而在幼虫四龄期,LdCncC和LdKeap1在蜕皮后24 h和60 h范围内,mRNA水平较高。测定了LdCncC和LdKeap1在不同组织的表达水平,发现LdCncC在幼虫中肠、前胸腺和卵巢高水平表达,而LdKeap1在幼虫脑-心侧体-咽侧体复合体、卵巢、前肠和前胸腺以较高水平表达。为了确定是否需要促前胸腺激素PTTH-Torso信号来激活体内LdCncC和LdKeap1的转录,应用RNA干扰技术沉默了幼虫体内该通路重要基因LdPTTH、LdTorso和LdRas,分析了处理幼虫中LdCncC和LdKeap1的mRNA水平,发现LdCncC和LdKeap1的表达量显著下调。2、沉默LdCncC和LdKeap1对幼虫生长发育的影响为了证实LdCncC和LdKeap1在幼虫发育中的生理作用,我们在每个基因的共同序列区构建了两种dsRNA,分别喂食马铃薯甲虫四龄初幼虫。生测数据表明,喂食dsLdCncC的幼虫发育时间延长,四龄幼虫和蛹的鲜重增加,并且具有更大的体型。喂食dsLdKeap1的幼虫,也具有相似的表型。喂食dsLdCncC和dsLdKeap1还显著下调了 Ldspo、Ldphm、Lddib和Ldsad的表达,但不影响Ldshd的转录。试虫中的20E滴度显著降低。此外,沉默LdCncC和LdKeap1显著降低了 5种20E应答基因(LdEcR-A、LdUSP、LdE75、LdHR3 和 LdFTZ-F1)的转录水平。JH滴度在LdCncC 和 LdKeap1 被干扰的幼虫中没有显著影响。将20E回补至LdCncC和LdKeap1被干扰的幼虫后,发育期、幼虫和蛹的鲜重以及5种20E应答基因(LdEcR-A、LdUSP、LdE75、LdHR3和LdFTZ-F1)的转录水平均恢复正常。可见,LdCncC和LdKeap1都参与调节马铃薯甲虫蜕皮激素的合成。3、沉默LdCncC和LdKeap1对解毒代谢相关基因的影响已有报道表明,CncC/Keap1信号参与了黑腹果蝇一系列解毒基因的转录调控。我们应用qRT-PCR检测马铃薯甲虫谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)家族基因、羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)和细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase,P450)基因的表达水平。检测结果表明,沉默LdCncC和LdKeap1后,部分谷胱甘肽转移酶家族基因、羧酸酯酶基因和细胞色素P450单加氧酶基因的表达水平都发生了变化。其中在LdCncC RNA干扰幼虫中,检测的14个LdGSTd和LdGSTe基因中,11个基因的表达水平显著下调;检测的9个细胞色素P450单加氧酶基因中,6个基因的表达水平显著下调,1个基因表达水平显著上调;检测的11个羧酸酯酶基因中,有8个基因显著下调。而在LdKeap1RNA干扰幼虫中,检测的14个LdGSTd和LdGSTe基因中,5个基因的表达水平显著下调,4个基因的表达水平显著上调;检测的9个细胞色素P450单加氧酶基因中,6个基因的表达水平显著下调,2个基因表达水平显著上调;检测的11个羧酸酯酶基因中,7个基因表达水平显著下调,3个基因表达水平显著上调。可见,马铃薯甲虫中,CncC/Keap1信号参与了马铃薯甲虫解毒基因的转录调控。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S433.5

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